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噬菌體展示可使抗體親和力提高到1000倍以上。很典型的起始點(diǎn)是自噬菌體抗體文庫(kù)中分離特異性抗體。為完成親和力的成熟（親和力的增加），要對(duì)抗體序列進(jìn)行多樣化；突變基因文庫(kù)展示在絲狀噬菌體表面上，并在抗原上選擇具有更高親和力的結(jié)合性抗體。盡管整個(gè)過(guò)程已相當(dāng)清晰，但研究者在進(jìn)行體外親和力成熟前必須明確：提高特定抗體親和力將會(huì)產(chǎn)生預(yù)期的生物學(xué)效果。當(dāng)嘗試用抗體中和循環(huán)中的毒素或生長(zhǎng)因子時(shí)，更高的親和力就顯得特別重要。在此情況下，抗體與抗原都分布于同樣的區(qū)域，能使抗原抗體的相互作用達(dá)到...
利用含有目標(biāo)受體的復(fù)雜混合物，對(duì)噬菌體展示肽文庫(kù)進(jìn)行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細(xì)胞或組織表面等。在此情況下，目標(biāo)就是要鑒定出結(jié)合于特定受體分子或結(jié)合于一組具有特定性質(zhì)的受體上的多肽。我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關(guān)的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結(jié)合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來(lái)鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關(guān)抗體的相應(yīng)配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來(lái)自HCV感染者和非感染者的血清（以下...
實(shí)驗(yàn)過(guò)程的zui后步驟是以合成每一個(gè)結(jié)合性或定位性的多肽來(lái)作為熒光標(biāo)記多肽[典型的熒光素或若丹明（rhodamine）]，然后在靜脈注射后測(cè)定其生物分布的。熒光標(biāo)記也使得多肽能在隨后的沒(méi)有任何修飾的受體分離中被使用：可以使用熒光多肽在基于細(xì)胞的表達(dá)性克隆系統(tǒng)中分類(lèi)受體陽(yáng)性的細(xì)胞，并且也可以通過(guò)高親和性的鼠抗熒光素單抗體的使用把熒光多肽直接固定到固體基質(zhì)上。在有偶合劑（couplingreagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情況下，加入異硫氰酸熒光素I（f...
1．使用來(lái)自篩選出的噬菌粒克隆的模版DNA，以及包含與AP融合表達(dá)載體的克隆位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。2．通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。選擇相應(yīng)方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。3．用對(duì)應(yīng)于克隆位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法將此產(chǎn)物連接到相同酶切后的AP融合蛋白表達(dá)載體中。4，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，鋪到含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上。挑取單克隆，利用標(biāo)準(zhǔn)的方法（如限制性酶切或PCR）鑒定是否有...
麥芽糖結(jié)合蛋白ELISA的方法與以前論文所述一致[1Sj，除了從大腸桿菌中釋放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我們發(fā)現(xiàn)，使用商業(yè)性的去垢劑（Pierce公司的B-PER抽提試劑）較溶菌酶能更簡(jiǎn)單有效地裂解細(xì)菌細(xì)胞。3ml培養(yǎng)基中的經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞先通過(guò)沉降，再通過(guò)含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重懸。于室溫下放置20分鐘后，離心5分鐘以除去細(xì)胞碎片，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中。裂解物于一70~0凍存，當(dāng)用于ELISA反應(yīng)時(shí)按1：50稀釋。在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中，我們發(fā)現(xiàn)...
1．合成需要的靶標(biāo)DNA或RNA寡核苷酸，其中一組是5’端連接生物素的寡核苷酸鏈。為dsDNA位點(diǎn)合成一條不聯(lián)結(jié)生物素的互補(bǔ)副鏈。2．①對(duì)于DNA位點(diǎn)的篩選，將每條寡核苷酸鏈各取10u1，與20/A1的2X核酸退火緩沖液混勻，讓兩條互補(bǔ)的寡核苷酸退火。在PCR儀中以94℃加熱樣品3分鐘，然后以每分鐘2℃的速度冷卻至4℃。冷卻后，用水將溶液稀釋至1pmol/L的終濃度，于-20℃保存。②對(duì)于RNA位點(diǎn)篩選，用RNA折疊緩沖液（1XCM）配制1pm01/L的寡核苷酸溶液。將溶液加...
A.噬菌體的制備1．挑取含有源自文庫(kù)篩選的噬菌體克隆的單菌落。用滅菌牙簽挑取單菌落接種于滅菌圓底培養(yǎng)板的微孔內(nèi)，其中加有150ul含15ug/ml的四環(huán)素的2×TY培養(yǎng)基。用一個(gè)微孔培養(yǎng)展示野生型DNA/RNA結(jié)合區(qū)域的噬菌體，作為陽(yáng)性對(duì)照。以250r/min的速度小心振蕩微孔板，30℃培養(yǎng)16小時(shí)。2．在合適的吊斗式離心機(jī)中3700g離心96孔培養(yǎng)板15分鐘，以制備噬菌體上清液。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微孔板內(nèi)，4℃保存。B.噬菌體ELISA1，將生物素聯(lián)結(jié)的核酸靶標(biāo)位點(diǎn)（通...
植物體內(nèi)的一種激素脫落酸可幫助植物對(duì)抗干旱等惡劣生存條件，但科學(xué)界對(duì)這類(lèi)植物激素的具體作用機(jī)制卻知之甚少。西班牙等國(guó)研究人員日前發(fā)現(xiàn)脫落酸幫助植物抗旱的具體機(jī)制，為有效提高植物抗旱能力開(kāi)辟了新思路。此前研究曾發(fā)現(xiàn)，在正常環(huán)境下，植物體內(nèi)一種名為PP2C的蛋白質(zhì)會(huì)阻止脫落酸發(fā)揮作用，當(dāng)植物處于極度干旱條件下時(shí)，這種阻斷作用就會(huì)消失，植物細(xì)胞中脫落酸的含量上升，從而幫助植物抗旱。研究同時(shí)認(rèn)為，PP2C蛋白質(zhì)并不會(huì)直接作用于脫落酸，而是通過(guò)另外一群蛋白質(zhì)間接發(fā)揮作用。這些“中介蛋白...
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