前者以 [γ-32P] ATP為phosphate donor，利用T4 polynucleotide kinase的活性對帶有5’-OH的DNA進行標定。人工合成的寡核苷酸 （oligonucleotides） 5’端為-OH group，可直接用于kinase reaction；一般DNA片段，若5’端帶有phosphate group，先經phosphatase處理，再進行kinase reaction。 Filling-in reaction是將DNA以特定限制酶切開，露出recessed 3’ termini后，利用Klenow的活性把3’端補齊 （filling-in）；因此，只要加入適當的 [α-32P] dNTP，即可在DNA的3’端進行標定。

 

    此外，也可以應用bacteriophage T4 DNA polymerase 的3’→5’ exonuclease 活性制造recessed 3’termini，再進行filling-in。 至于正意股或反意股RNA探針，則可以 [α-32P] UTP或DIG-11-UTP等為標定物質，應用胞外轉錄反應加以標定。 下面要介紹的是目前zui常用的方法：random priming及PCR。